TINCIONES MICROBIANAS
Introducción
Los rasgos morfológicos de los organismos superiores se han utilizado durante muchos años para clasificar a éstos de una manera bastante efectiva. Debido a que los rasgos anatómicos de estos organismos son tan diferentes, resulta muy fácil utilizarlos como método de clasificación.
En cambio, los microorganismos lucen de una manera muy similar todos al ponerlos bajo la luz de un microscopio. Aunque la morfología de los microorganismos no los clasifica de una manera tan efectiva, si que sirve para identificarlos fácilmente.
Existen diferentes tipos de tinciones microbianas, que permiten que los microorganismos no luzcan todos por igual bajo la luz del microscopio, y así poder clasificarlos en función de algunas de sus características estructurales.
Tarea
Los alumnos realizarán en el laboratorio tres tipos de tinciones microbianas:
-Tinción de Gram
-Tinción de Ziehl – Neelsen o Ácido – Alcohol Resistente (AAR)
-Tinción de endosporas
Una vez realizadas estas tinciones, el alumno deberá clasificar las bacterias en función de los resultados obtenidos para cada tipo de tinción.
Por último, se proporcionarán al alumno distintas preparaciones de bacterias ya teñidas y deberá reconocer al microscopio el tipo de tinción utilizado en cada caso y el tipo de bacterias según cada tinción.
Proceso
Para llevar a cabo todas las tinciones, primero será necesario fijar la muestra. Para ello seguiremos los siguientes pasos:
- Colocaremos en un porta una gota de agua corriente.
- Con un asa, previamente esterilizada, cogeremos una muestra de la colonia de bacterias que queremos analizar, y la extenderemos por el porta con ayuda de la gota de agua. Este proceso se realizará cerca de una llama para mantener la preparación en condiciones de esterilidad.
- Luego calentaremos el porta sobre un mechero de alcohol hasta que el agua se evapore. Es muy importante mantener el porta a cierta distancia del mechero y siempre en movimiento para no quemar las bacterias; el agua del porta nunca debe llegar a hervir. Para sujetar el porta encima de la llama sin quemarnos utilizaremos unas pinzas de madera.
La muestra ya estará fijada para poder llevar a cabo las tinciones.
Todas las tinciones se llevarán a cabo colocando el porta en una rejilla dispuesta sobre un bol de vidrio o de plástico.
Tinción de Gram:
- Primero se cubre por completo el porta con la muestra, del colorante cristal violeta, y se deja actuar durante 1 minuto.
- Transcurrido el tiempo se aclara el colorante que no se haya fijado con abundante agua corriente, evitando que el agua golpee directamente sobre la muestra.
- A continuación se aplica sobre la muestra lugol durante 1 minuto. Éste actuará como mordiente, permitiendo que el cristal violeta se fije a las bacterias.
- Transcurrido el tiempo se vuelve a aclarar con agua abundante.
- El siguiente paso es decolorar la muestra con etanol; para ello inclinaremos el porta y echaremos 3 gotas de etanol en la parte superior, permitiendo que resbalen por todo el porta hasta la parte inferior de éste. Una vez que lleguen a la parte inferior aclararemos la muestra con abundante agua corriente.
Es importante realizar este paso lo más rápido posible, ya que el etanol arrastrará a su paso el colorante que no se haya fijado a la muestra, pero si se deja actuar más tiempo del debido, la destruirá.
- Por último, aplicaremos safranina, un colorante de contraste, durante 30 segundos a la muestra y aclararemos con abundante agua corriente.
- Para secar la muestra utilizaremos papel normal, presionando la muestra contra éste sin frotar. Una vez seca se pone un cubre sobre la muestra y observamos al microscopio:
Si el etanol no ha eliminado el primer colorante, las bacterias se verán de color morado, y diremos que nos encontramos ante bacterias Gram+.
Si por el contrario el etanol si ha eliminado el cristal violeta, las bacterias se observarán de un color rosado correspondiente a la safranina, y nos encontraremos ante bacterias Gram-.
Tinción de Ziehl – Neelsen:
- En primer lugar teñiremos la preparación con fucsina fenicada, dejando actuar al colorante 5 minutos. Durante este tiempo se calentará la muestra con un mechero del mismo modo que realizamos la fijación de las preparaciones, añadiendo más colorante cuando sea necesario para que la muestra no se seque.
- Transcurrido este tiempo aclararemos con abundante agua corriente.
- A continuación decoloraremos la preparación con ácido-alcohol, dejándolo actuar durante 30 segundos aproximadamente.
- Cuando la preparación tome un color rosado, aclararemos el exceso de disolvente con abundante agua corriente.
- Por último, teñiremos la muestra con azul de metileno, dejándolo actuar durante 1 minuto.
- Luego aclararemos con agua corriente y secaremos la preparación como en la técnica anterior.
Después de poner un cubre, al microscopio observaremos:
Si las bacterias son ácido-alcohol resistentes, no permitirán que el azul de metileno entre en sus estructuras, y se observarán de color rosa. (AAR+)
En cambio, tomarán el color azul del azul de metileno si no son ácido-alcohol resistentes. (AAR-)
Tinción de endosporas:
- En primer lugar se tiñe la preparación con verde malaquita, dejando actuar el colorante 5 minutos mientras se calienta la muestra como en el caso anterior, añadiendo más colorante para que la muestra no se seque.
- Una vez transcurrido el tiempo se aclara con abundante agua corriente.
- A continuación, se tiñe con safranina durante 1 minuto.
- Se aclara la preparación con abundante agua corriente.
- Se seca con papel, sin frotar, y se pone un cubre. En el microscopio se observará:
En el caso de que las bacterias tengan endosporas, se verán bacterias rosas con un punto verde azulado en su interior.
Si las bacterias no tienen endosporas, sólo se verán colonias de color rosa.
Recursos
El alumno podrá consultar por su cuenta todos los medios que estén a su alcance: libros, páginas web, videos, etc.
Aquí dejo el enlace a algunas páginas de internet que pueden ser interesantes para el alumno, y cito algún libro que puede ser de gran ayuda:
http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EElpZEVkykPMncqxmd.php
http://books.google.es/books?id=MfW3TuHLa4gC&pg=PA30&lpg=PA30&dq=tincion+acido-alcohol+resistente&source=bl&ots=4m1dRE
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker. Brock Biología de los microorganismos. Ed. Pearson. 2003
Evaluación
El 50% de la nota final de esta práctica consistirá en la realización de una de las tres tinciones. La tinción que se realice será elegida por el profesor en el momento del examen.
El otro 50% de la nota consistirá en la identificación al microscopio de 5 preparaciones bacterianas. Será necesario indicar el tipo de tinción y el tipo de bacteria según la tinción utilizada para cada una de las 5 preparaciones.
Conclusión
El objetivo que se persigue con esta práctica es que el alumno sepa realizar las tinciones microbianas básicas, y que sea capaz de reconocer estas tinciones al verlas ya hechas.
Además de saber identificar diferentes tipos de bacterias en función de las características estructurales que se ponen de manifiesto con estas tinciones.
